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«Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt ...»

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The Influence of Matrix Properties on Cell Migration

in Disordered 3-Dimensional Biopolymer Networks

Der Einfluss von Matrixeigenschaften auf die Migration von Zellen in

unregelmäßigen 3-dimensionalen Biopolymernetzwerken

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Nadine Ramona Lang

aus München

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander – Universität Erlangen Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 17.12.2014 Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms Erstgutachter: Prof. Dr. Ben Fabry Zweitgutachter: Prof. Dr. Aldo Boccaccini Disclosure Statement VII Disclosure Statement

Parts of this dissertation were published in:

Lang N.R., Münster S., Metzner C., Krauss P., Schürmann S., Lange J., Aifantis K.E., Friedrich O. and Fabry B.

Estimating the 3D Pore Size Distribution of Biopolymer Networks from Directionally Biased Data Biophysical Journal 105(9):1967-75, (2013).

DOI: 10.1016 / j.bpj.2013.09.038 and submitted to Lang N.R., Skodzek K., Hurst S., Mainka A., Steinwachs J., Schneider J., Aifantis K.E and Fabry B.

Biphasic response of cell invasion to matrix stiffness in 3-dimensional biopolymer networks Acta Biomaterilia, (re-submitted, September 2014)

CONTENTS IX

CONTENTS

Disclosure Statement

CONTENTS

ZUSAMMENFASSUNG

ABSTRACT

I INTRODUCTION

II MATERIALS AND METHODS

2.1 Collagen gel preparation

2.2 Preparation of fluorescently labeled collagen gels

2.3 Preparation of unlabeled and labeled fibrin gels

2.4 Confocal microscopy

2.5 Second harmonic generation imaging

2.6 Binarization of image stacks

2.7 Pore size evaluation with covering radius transform

2.8 Evaluation of fiber orientation

2.9 Magnetic tweezer

2.10 Extensional rheometer

2.11 Cross-linking of collagen gels

2.12 Cell culture

2.13 Invasion assay preparation and analysis

2.14 MMP inhibitor treatment

2.15 Transfection

2.16 Live cell imaging - 2D tracking

2.17 Cell shape analysis

2.18 Extraction of primary breast cells and cultivation

2.19 Amnion preparation

III RESULTS AND DISCUSSION

–  –  –

3.1.1. Morphological properties of biopolymer networks

3.1.2. Mechanical properties of biopolymer networks

3.1.3 Influence of morphological and mechanical properties on cell migration............ 44 3.1.5 The influence of Matrix metalloproteinase in gels with and without glutaraldehyde

3.1.6 Conclusion

3.2 Effects of transfection with fluorescently tagged proteins on cell migration in 3D.... 51 3.2.1 Introduction – why do we use transfection?

3.2.2 Transfection with fluorescent proteins can impair cell behavior

3.2.3 Conclusion

3.3 The co-dependence of matrices and cell types

3.3.1 Introduction – the variety of matrix and implant materials

3.3.2 Cell migration in different matrices

3.3.3 Different cell types prefer different matrices

3.3.4 New frontiers – the human amnion as a substitute material for cell migration experiments

3.3.5 Conclusion and outlook

IV. SUMARY AND CONCLUSION

V. OUTLOOK

REFERENCES

APPENDIX

SUPPLEMENTARY INFORMATION

Danksagung

Publication List

Curriculum Vitae

–  –  –

ZUSAMMENFASSUNG

Migrierende Zellen sind an allen Prozessen des Lebens beteiligt: von der Embryogenese über die Wundheilung bis hin zu Metastasenbildung während einer Krebserkrankung.

Im Gegensatz zu flachen, 2-dimensionalen Substraten sind Zellen während ihrer Migration durch ein 3-dimensionales Biopolymernetzwerk von Matrix umgeben. Dabei wird vermutet, dass die Eigenschaften der Matrix, wie zum Beispiel deren Porengröße oder Steifigkeit, das Zellverhalten beeinflussen. Diese Eigenschaften zu kennen ist daher von großer Wichtigkeit. Eine weit verbreitete Methode die Porengrößen dieser Netzwerke zu bestimmen, ist die Verwendung von konfokaler Reflexionsmikroskopie.

Allerdings werden bei dieser Methode unvollständige Datensätze erzeugt, da keine senkrechten Fasern aufgelöst werden können. In porösen 3-D Biopolymernetzwerken wie Kollagen ist es zudem schwierig, den Einfluss von Matrixsteifigkeit auf die Zellmigration unabhängig vom Einfluss der Porengrößen und der adhesiven Liganden zu betrachten.

Diese Promotionsarbeit zeigt, wie die Eigenschaften von extrazellulärer Matritzen bestimmt und die Einflüsse von Matrixsteifigkeit und Porengröße unabhängig voneinander betrachtet werden können. Um die korrekte 3-dimensionale Porengröße aus unvollständigen Daten zu berechnen, werden zunächst die Distanzverteilungen zufälliger Punkte der Porenzwischenräume zur nächstgelegenen Faser bestimmt. Diese Verteilung folgt einer Rayleigh Verteilung (unabhängig davon, ob das Netzwerk isotrop ist oder nicht), welche durch einen einzigen freien Parameter bestimmt wird - die charakteristische Porengröße des Netzwerkes. Aufgrund der fehlenden Fasern in der Reflexionsmikroskopie, kommt es zu einem Fehler bei der Abschätzung der Porengröße der Netzwerke, der aber durch Multiplikation mit dem, in dieser Arbeit berechneten, Korrekturfaktor ausgeglichen werden kann. Wir bestätigen dieses Vorgehen experimentell durch einen Vergleich mit Daten aus der Fluoreszenzmikroskopie, welche die komplette Netzwerkstruktur widerspiegeln.





Um die Einflüsse der Matrixsteifigkeit auf die Zellmigration von denen der Porengröße zu trennen, verwenden wir Glutaraldehyd als Vernetzer, der die Gelsteifigkeit erhöht, ohne gleichzeitig die Porengröße zu verändern. Die Invasivität der Zellen nahm in Gelen mit Porengrößen über 5 µm zu, wenn die Gelsteifigkeit erhöht wurde. Im Gegensatz dazu sank die Invasivität der Zellen in Gelen mit kleineren Poren, wenn die Gelsteifigkeit erhöht wurde. Diese Daten zeigen, dass 3-D Zellmigration von höherer Gelsteifigkeit begünstigt wird, im Gegensatz zur Zellmigration in 2-D, solange

XII ZUSAMMENFASSUNG

die Porengröße nicht unter einen kritischen Wert fällt, ab dem sie eine übermäßige sterische Behinderung darstellt.

Darüber hinaus wird in dieser Arbeit der komplexe Zusammenhang der Migration verschiedener Zelltypen aus dem gleichen Ursprungsgewebe in verschiedenen Matrixmaterialien gezeigt. Schließlich wird gezeigt, dass das humane Amnion als komplett natürliches Ersatzmaterial für das Erforschen von Zellmigration in der Zellkultur verwendet werden kann.

Diese Erkenntnisse können bei der Optimierung der Neubesiedelung von Weichteilimplantaten oder der Entwicklung eines Modelles der Tumor- und Metastasenbildung in der Krebsforschung helfen und in der Zukunft eine große Rolle spielen.

Abstract

XIII

ABSTRACT

Cell migration through 3-dimensional matrices is involved in numerous biological processes, ranging from embryogenesis to wound repair and the progression of metastases. In contrast to flat 2D surfaces, cells in a 3D environment, for example a biopolymer network, are surrounded by matrix material. The properties of the matrix material like pore size or stiffness are suspected to impact the behavior of embedded cells. Knowing these properties is therefore of crucial importance. To evaluate the pore size of such biopolymer networks, confocal reflectance microscopy is a widely used method. However, it fails to resolve vertical fibers and produces directionally biased images of the networks. Moreover, for porous 3D networks such as collagen, it is difficult to separate the effect of matrix stiffness on cell migration from effects of matrix pore size and adhesive ligand density, and is therefore unknown.

This work demonstrates how the properties of extracellular matrices can be evaluated and the effects of matrix stiffness and pore size on cell migration can be separated. To estimate the true 3D pore size from directionally biased data sets, we first determine the distribution of distances from random points in the fluid phase to the nearest fiber. This distribution follows a Rayleigh distribution, regardless of isotropy and data bias, and is fully described by a single parameter - the characteristic pore size of the network. The bias of the pore size estimate due to the missing fibers can be corrected by multiplication with the square root of the visible network fraction. We experimentally verify the validity of this approach by comparison with data obtained using confocal fluorescence microscopy, which represents the full structure of the network.

To separate the effects of matrix stiffness and pore size on cell migration, we used glutaraldehyde as a cross-linker to increase the stiffness of self-assembled collagen biopolymer networks independently of collagen concentration or pore size. Cell migration in gels with pore sizes larger than 5 µm increased with higher gel stiffness, whereas migration in gels with smaller pores decreased with higher gel stiffness. These data show that 3D cell migration is enhanced by higher matrix stiffness, opposite to cell behavior in 2D, as long as the pore size does not fall below a critical value where it causes excessive steric hindrance.

In addition, we show the complex dependence of cell migration from different cell types, all originated in breast tissue, on matrix properties like stiffness, pore size and matrix composition. Finally we show that the human amnion can be used as a natural substitute material to study cell migration.

XIV ABSTRACT

–  –  –

The ability of cells to migrate through their surrounding 3-dimensional (3D) extracellular matrix (ECM) is crucial for many biological processes like wound repair, embryogenesis, tumor progression and metastasis formation, but also for the recellularization of biomaterials and the revascularization of porous implants [1-5].

While the role of intracellular processes, like the polymerization of actin to form protrusions, has been studied extensively [6, 7], the influence of morphological and mechanical properties of the surrounding matrix has yet to be defined.

Studies of cells grown on flat 2-dimensional (2D) substrates have shown that in particular the mechanical properties of the underlying substrate has great influences on cell migration [8, 9]. On a more rigid substrate, cells form more stable focal adhesions, which leads to a reduced migration speed and contributes to durotaxis where cells migrate in the direction of increasing substrate stiffness [10, 11].

In a 3D environment, the migrating cells must, in addition to adhesion forces, also overcome the resisting forces imposed by the surrounding matrix [12-14]. Resisting forces arise from steric effects as the cell moves through the matrix and deforms it. This steric hindrance depends on cell shape and cell mechanics but is also modulated by the effective mechanical properties of the matrix. In a porous matrix, however, the effective mechanical properties also depend on the porosity or the mesh size of the matrix [15The mesh size of the extracellular matrix (ECM) is an important parameter that influences also the ability of cells to colonize and migrate through the ECM [12, 20, 21].

2 I INTRODUCTION

Figure 1.1: Cells in a 3-dimensional biopolymer network imaged with confocal microscopy. (A) Reconstructed image stack (total thickness 18 µm) of a breast carcinoma cell embedded in a dilute, 3-dimensional collagen gel of concentration 0.3 mg/ml with larger pore size. (B) Brest carcinoma cell embedded in a dense, 2.4 mg/ml collagen gel with smaller pore size. Images were reconstructed from 3D confocal image stacks with AMIRA (512x512 pixels, 174 nm x 174 nm x 241 nm).

Artificial three-dimensional extracellular matrices from self-assembled protein networks are widely used for tissue engineering applications and for studying cell behavior in an environment that more closely resembles the in-vivo physiologic situation of mammalian cells [14, 22]. Knowing the exact pore size is crucial because the ability of cells to migrate through steric constrictions drops sharply when the pore size falls below a critical value [23, 24]. Moreover, the pore size of the network matrix strongly influences cell behavior such as adhesion and polarization, and therefore needs to be measured accurately [20, 25, 26].

–  –  –

Figure 1.2: The structure of collagen.

(A) Hierarchical structure of collagen. The triple helical collagen monomer assembles into fibrils which form collagen fibers that associate into the network (Figure reproduced from [29]). (B) SEM image from a collagen network show detailed information about fiber structure and pores (image dimensions 100,000X images, bar represents 500nm, image adapted from [30]).

Another important biopolymer network is fibrin, which provides the structural scaffold of blood clots but is also frequently used in tissue engineering applications and cell culture [31, 32]. Fibrin networks form during coagulation, when monomeric fibrin assembles into protofibrils that laterally aggregate into thicker fibers and occasionally branch to form a percolated, three-dimensional structure [33] (Fig. 1.3).

In both, collagen and fibrin networks, changes in fiber diameter and density strongly affect the mechanics of these network [15-17, 34] as well as the adhesion, spreading, polarization and migration of embedded cells [12, 14, 21, 22, 35]. These biological effects are attributable not only to the mechanical network properties or adhesive ligand density, but also to the morphological structure of the network, most notably the pore size.

Figure 1.3: The structure of fibrin.

(A) Hierarchical structure of fibrin. The cleavage of fibrinopeptides allows „knob-hole‟ interactions between fibrin monomers, causing the fibrin monomers to polymerize and form protofibrils and fibers. (Figure reproduced from [36]).



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