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«Die protektive Wirkung von Cyclosporin A während der Ischämie und der Reperfusion Untersuchungen am global ischämischen Hundeherzen ...»

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Dabei entspricht die Struktur von Bcl-xL größtenteils den porenformenden Abschnitten einiger bakterieller Toxine 186. Von der daraus resultierenden Fähigkeit berichteten Schendel et al. 188. Bei ihren Versuchen an synthetischen Membranen bildeten sowohl Bcl-xL, wie auch Bcl-2 und Bax unterschiedliche funktionierende pH- und spannungsabhängige Ionenkanäle. Während Bcl-2 und Bcl-xL nur unter „unphysiologischen“ Bedingungen (niedriger pH-Wert) zu Porenbildung neigen, entstehen die Bax-induzierten Ionenkanäle bei neutralem pH-Wert 189. Dementsprechend könnte die pro-apoptotische Wirkung von Bax durch die porenbildende Fähigkeit des Proteins hervorgerufen werden (Abb. 36). Hierbei würde Cytochrom C durch die nichtselektiven Ionenkanäle aus den Mitochondrien freigesetzt, gefolgt von einer Aktivierung der Caspasenkaskade. Allerdings bleibt fraglich, ob die in synthetischen Lipidmembranen gebildeten Kanäle auch in vivo existieren und ob das Lumen für die Passage von Cytochrom C ausreicht.

V. Diskussion - 101 Abb. 36: Die Abbildung veranschaulicht die hypothetische Entstehung der BaxPoren. Dabei führt die Heterodimerisation verschiedener Bax-Moleküle zur Ausbildung tansmembranöser Poren, durch die Cytochrom C freigesetzt wird.

Im Gegensatz dazu spielt die Porenbildung bei den anti-apoptotischen Proteinen in vivo keine Rolle. Vielmehr beschützt Bcl-2 als „Wächter der Mitochondrien“ die Organellen vor der toxischen Bax-Wirkung. Dabei verhindert Bcl-2 die Bildung von Bax-induzierten Ionenkanälen 1 9 0 durch Heterodimerisation mit dem proapoptotischen Protein. Dies ist ein Vorgang, bei dem die aus den BH-1, -2 und -3 Regionen gebildete hydrophobe Tasche des Bcl-2’s die pro-apoptotische BH-3Domäne des Bax-Proteins bindet 191.

5.4. Bedeutung von Bcl-2 und Bax im beschriebenen Modell

Zusammengefasst zeigen die beschriebenen Mechanismen, dass die Entscheidung über Leben oder Tod der Zelle durch die Bcl-2-Familie auf zwei verschiedenen Wegen erfolgen kann. Zum einen hemmt die Heterodimerisation von pro- und antiapoptotischen Proteinen die direkte toxische Wirkung von Bax. Zum anderen regulieren die einzelnen Mitglieder die Apoptose über unabhängige Funktionen.

Allerdings entscheidet in beiden Fällen die relative Konzentration pro- und antiapoptotischer Proteine über die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber der Apoptoseinduktion, wobei insbesondere das Verhältnis zwischen Bcl-2 und seinem direkten Gegenspieler Bax von großer Bedeutung ist 69,151.

Dementsprechend müssen die Ergebnisse der Bcl-2 und Bax-Western Blots vor allem in Bezug auf das Verhältnis der beiden Proteine beurteilt werden. Da die Gesamtmenge an Bax nach der Ischämie im Gegensatz zur Gesamtmenge an Bcl-2 nur minimal ansteigt, verlagert sich das Verhältnis in beiden Versuchsgruppen zugunsten des anti-apoptotischen Bcl-2’s. Der daraus resultierende protektive Effekt ist vermutlich einer der Gründe für die geringe Apoptoserate trotz 18stündiger Ischämie. Dieser Effekt bleibt auch während der ersten 2 Stunden der Reperfusion erhalten, da die relative Bcl-2-Konzentration zu diesem Zeitpunkt

- 102 - V. Diskussion immer noch überwiegt. Erst nach 6stündiger Reperfusion erfolgt ein signifikanter Abbau der pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Familienproteine in beiden Gruppen.

Hieraus folgt, dass zum Ende der Reperfusion keinerlei Apoptose-induzierende Faktoren wirksam sind. Dies wiederum unterstützt die unter Punkt 3.2.

aufgestellte Hypothese, die von einer Auslösung der Apoptose während der Ischämie ausgeht.

Obwohl noch viele Untersuchungen zur endgültigen Klärung der Wirkungsmechanismen notwendig sind, sprechen die am Modell ermittelten Ergebnisse für eine Beteiligung der Mitochondrien an der Steuerung der Apoptose. Unter anderem weist der relativ geringe 50%ige Abfall der Cytochrom C-Gesamtmenge in der unbehandelten Gruppe auf eine gehemmte Freisetzung der pro-apoptotischen mitochondrialen Faktoren während der Ischämie hin. Allerdings erlauben die Ergebnisse keine Rückschlüsse, ob es sich dabei um direkte (siehe Punkt 5.3.1.) oder indirekte (siehe Punkt 5.3.2.) Einflüsse des Bcl-2’s handelt.

6. Mechanismus und Hemmung der Calcineurin-bedingten Apoptose

Obwohl Calcineurin ursprünglich nur als Regulator der Herzhypertrophie diskutiert wurde 106,108, weisen immer mehr Publikationen auf eine wichtige Rolle der Phosphatase bei der Regulation der Apoptose in Kardiomyozyten. Diese Beobachtung wurde mittlerweile für eine Vielzahl verschiedener Zelltypen beschrieben, wobei die Wissenschaftler sowohl pro- als auch anti-apoptotische Effekte des Enzyms nachweisen konnten 192-194.

Die gleiche Kontroverse betrifft auch die Herzmuskelzellen. Während Kakita et al. 195 und De Windt et al. 196 von einer Hemmung der Apoptose durch Calcineurin berichten, beweisen die Ergebnisse von Saito et al. 1 9 7 und W a n g e t a l. 1 9 8 eine gegenteilige Wirkung. In diesem Zusammenhang veröffentlichten Kakita et al. 195, dass Calcineurin in vitro die durch H2O2 induzierte Apoptose von Rattenkardiomyozyten verhindert. Zum gleichen Ergebnis kamen De Windt et al. 1 9 6 bei ihren in vivo Versuchen mit transgenen Calcineurinüberexprimierenden Mäusen. Diese Mäuse, die eine aktive Form des Enzyms im Herz exprimierten, zeigten einen signifikant verbesserten Schutz vor der DNAFragmentierung.





Im Gegensatz dazu präsentierten Wang et al. einen sehr wirkungsvollen proapoptotischen Mechanismus des Calcineurins. Sie erkannten, dass Calcineurin in vitro das pro-apoptotische Bcl-2-Familienmitglied BAD dephosphoryliert, gefolgt V. Diskussion - 103 von einer Heterodimerisation zwischen Bad und Bcl-2 199. Durch die Bindung mit dem pro-apoptotischen BAD verliert Bcl-2 seine anti-apoptotische Wirkung, was wiederum zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führt. Dabei korreliert die Ca2+-induzierte Dephosphorylierung mit der Dissoziation des BAD’s vom zytosolischen 14-3-3-Protein. Da diese, immer mit einer Translokation auf die Mitochondrienmembran verbundene, Reaktion Calcineurin-induziert ist, lässt sie sich mit CsA hemmen (Abb. 37).

Diesbezüglich stellten auch Saito et al. in einer kürzlich erschienenen Publikation fest, dass BAD bei der Isoproterenol-induzierten Apoptose dephosphoryliert wird. Außerdem untersuchten sie die intrazelluläre Verteilung von Cytochrom C. Dabei ergab sich einerseits eine signifikante Erhöhung der zytosolischen Cytochrom C-Gesamtmenge in Anwesenheit von Isoproterenol, andererseits konnte die Freisetzung des Proteins mit Hilfe des Calcineurininhibitors CsA reduziert werden. Wahrscheinlich beruht der Übergang des Cytochrom C’s auf einer Hemmung des anti-apoptotischen Bcl-2’s durch das dephosphorylierte BAD.

In Bezug auf unser Modell weisen die Ergebnisse der Cytochrom C-Western Blots und der TUNEL-Methode auf den von Wang et al. erstmalig beschriebenen Mechanismus. Dementsprechend verhindert die nachgewiesene Blockade der Calcineurinaktivität durch CsA die Freisetzung des Cytochrom C’s aus den Mitochondrien, gefolgt von einer Reduktion der Apoptoserate in der behandelte Gruppe. Allerdings wird die Interpretation der Ergebnisse durch die Komplexität des Modells erschwert. Insbesondere der direkte Effekt von CsA auf die PTPorenöffnung stellt einen weiteren sehr wirkungsvollen Schutz vor der Apoptose dar.

Ein weiterer Hinweis auf die paradox anmutende Wirkung von Calcineurin ergibt sich aus den Beobachtungen von Lotem et al. 200. Ihre Resultate zeigen, dass Calcineurin in den gleichen Zellen sowohl pro- als auch anti-apoptotisch wirken kann, wobei sich die beiden auslösenden Kaskaden erst nach der Calcineurinaktivierung trennen.

Neben der Aktivierung von BAD durch Calcineurin entdeckten Shibasaki et al. 105 1997 einen weiteren Zusammenhang zwischen dem Enzym und der Bcl-2-Familie.

Sie berichteten, dass Bcl-2, als bekanntestes anti-apoptotisches Mitglied der Familie, in vitro eine feste Komplexbindung mit Calcineurin eingeht, wodurch die Phosphatase an die Mitochondrienmembranen gebunden wird. Dabei hemmt Bcl-2 die durch Calcineurinüberexpression ausgelöste Apoptose in transgenen Mäusen 201.

- 104 - V. Diskussion Allerdings bleibt unklar, in welchem Maße dieser Vorgang in unserem Modell eine Rolle spielt und ob es zu der von Shibasaki et al. 105 gezeigten Hemmung der Komplexbildung durch die Heterodimerisation von Bax und Bcl-2 kommt.

Abb. 37: Modellvorstellung der Calcineurin-induzierten Apoptosekaskade.

7. Schlussfolgerung und Zukunftsperspektiven Zusammenfassend zeigen die Resultate, dass die Kombination aus Hypothermie und Kardioplegie mit CsA-angereicherter UW-Lösung zu einer signifikanten Verbesserung der Ischämietoleranz global ischämischer Herzen führt. Dabei ermöglicht die CsA-induzierte Hemmung der mitochondrialen PT-Pore die vollständige funktionelle Erholung nach 18stündiger Ischämie. Diese Hemmung verhindert einerseits die durch Freisetzung von Cytochrom C und AIF ausgelöste Apoptose, andererseits verringert sie den Grad der ischämischen Schädigung.

Insgesamt deuten die Ergebnisse auf eine mögliche Bedeutung von CsA für humane Herztransplantationen, da diese Eingriffe durch die Dauer der Herzaufbewahrung limitiert werden. Folglich könnte man CsA-perfundierte Spenderherzen über eine viel längere Strecke transportieren, was wiederum zu einer massiven Vergrößerung des Donorpools führen würde. Außerdem wäre eine schnellere funktionelle Erholung nach der Transplantation, sowie eine erhöhte Überlebensrate zu erwarten.

–  –  –

im Hinblick auf die Regulation der Apoptose erforscht werden. Unabhängig davon weist die Veröffentlichung von Massoudy et al. 2 0 2 auf einen alternativen kardioprotektiven Mechanismus. Sie berichten, dass CsA in Meerschweinchenherzen die Freisetzung von NO stimuliert, gefolgt von einer Hemmung der Caspasenkaskade 152. Allerdings ist nicht bekannt, ob dieser Mechanismus auch bei Hunden und Menschen vorkommt.

Dementsprechend sind eine Vielzahl weiterer Versuche notwendig, bevor die Substanz endgültig eingesetzt werden kann. In diesem Zusammenhang sind vor allem die Kombination von CsA mit anderen kardioplegischen Lösungen und der Einsatz anderer Versuchstierspezies von großer Bedeutung. Ein weiterer Ansatzpunkt ergibt sich aus der häufigen Anwendung von CsA bei der Immunsuppression nach Herztransplantationen. Hierbei könnte die genaue Beurteilung der Krankenakten wichtige Hinweise auf die protektive Wirkung von CsA geben. Allerdings ist dabei zu beachten, dass die Behandlungen nicht unter standardisierten Bedingungen durchgeführt wurden.

VI. Zusammenfassung - 107 VI. ZUSAMMENFASSUNG

Ziel dieser Arbeit war es die protektive Wirkung, sowie die dazugehörigen Wirkungsmechanismen von Cyclosporin A (CsA) an einem Langzeitischämie-Modell beim Hund zu untersuchen. Hierzu wurden zwölf Spenderherzen während einer 18stündigen globalen Ischämie unter hypothermen Bedingungen mit „University of Wisconsin“(UW)-Lösung perfundiert und anschließend 6 Stunden von einem Empfängertier reperfundiert. Dabei wurden sechs Herzen mit CsA (10-5 mol/l) behandelt, während die unbehandelten Organe als Kontrolle dienten. Die vor (A) und nach (B) der Ischämie sowie nach zwei (C) bzw. sechs (D) Stunden Reperfusion entnommenen Biopsien wurden anschließend histologisch untersucht.

Außerdem wurden im Verlauf der Reperfusionsphase stündlich Funktionsparameter bestimmt, deren Auswertung die protektive Wirkung von CsA zeigte.

Während sich die kontraktile Funktion in der behandelten Gruppe vollständig erholte, erreichte die endsystolische Elastizität der unbehandelten Herzen nur 50% der Kontrollwerte.

Im zweiten Teil der Studie sollten die möglichen Ursachen für die protektiven

Effekte von CsA erforscht werden, wobei sich folgende Resultate ergaben:

Im Elektronenmikrokop zeigten die meisten Präparate nach der 18stündigen Ischämie eine reversible Schädigung. Allerdings war der Schädigungsgrad in den mit CsA perfundierten Herzen weitaus geringer.

Weiterhin wurde in keinem der Präparate elektronenmikroskopische Anzeichen nekrotischer Zellen gefunden. Dafür spricht auch die fehlende Markierung nach der Complement C9 Färbung.

Im Gegensatz dazu stieg der mittels TUNEL-Methode bestimmte Anteil an apoptotischen Zellen zum Ende der Reperfusion signifikant auf 5,9% in der unbehandelten Gruppe. Diese Apoptoserate wurde durch die Gabe von CsA um mehr als 50% auf 2,4% gesenkt. Im weiteren Verlauf wurden die Ergebnisse der TUNEL-Methode durch die Resultate der Lamin B1-Färbung bestätigt. Während die Reduktion von Lamin B1-positiven Kernen in der D-Biopsie der CsA-freien Gruppe 93% betrug, fiel der Anteil in der CsA-Gruppe auf 97%. Die gleiche Tendenz ergab sich aus der Lamin A-Färbung, wobei der Anteil an negativen Kernen nach 6stündiger Reperfusion bei 27% (ohne CsA) bzw. 5% (mit CsA) lag.

Um die genauen Mechanismen der Protektion zu erforschen, wurden verschiedene Proteine mittels der Western Blot-Technik ausgewertet. Dabei ergab insbesondere die quantitative Auswertung des mitochondrialen Cytochrom C-Gehaltes zum Ende der Ischämie einen signifikanten Unterschied. Während das partikuläre Cytochrom C in den mit CsA perfundierten Herzen nur auf 73% der Ausgangsmenge fiel, verringerte sich der Gehalt ohne CsA auf 48%. Dagegen reduzierte sich der

- 108 - VI. Zusammenfassung

Gehalt an Bax-Protein erst nach 6 Stunden Reperfusion auf 65% (ohne CsA) bzw.

71% (mit CsA). Gleiches galt für das Bcl-2-Protein, wobei die Gesamtmenge nach der Ischämie leicht anstieg, bevor der Gehalt zum Ende der Reperfusion auf 70% ohne und 81% mit CsA abfiel.

Entsprechend verringerte sich die Gesamtmenge an Calcineurin nach 6stündiger Reperfusion auf 64% (ohne CsA) bzw. 72% (mit CsA) der Ausgangsmenge.

Allerdings führte die Perfusion der Herzen mit CsA zu einer vollständigen Hemmung der Calcineurinaktivität während der Ischämie und der Reperfusion, während die Enzymaktivität ohne die Behandlung mit CsA erst nach 6 Stunden Reperfusion auf 70% der Ausgangsaktivität fiel.

In Bezug auf alpha-Aktinin und Aktin konnten im Western Blot keine Mengenunterschiede zwischen den einzelnen Zeitpunkten festgestellt werden. Hingegen zeigte die immunhistochemische alpha-Aktinin-Markierung in den C- und DBiopsien beider Gruppen offensichtliche Veränderungen, die sich als Areale mit aufgelöster und diffuser Querstreifung darstellten.



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