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«Die protektive Wirkung von Cyclosporin A während der Ischämie und der Reperfusion Untersuchungen am global ischämischen Hundeherzen ...»

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des Literaturteils). Gleichzeitig wird der „apoptosis-inducing-factor“ (AIF) aus den

- 94 - V. Diskussion Mitochondrien freigesetzt (Abb. 33). Dieser Faktor verursacht Caspaseunabhängige apoptotische Veränderungen im Zellkern und an den Membranen 153.

Trotz intensiver Forschung konnte der Zusammenhang zwischen den beiden Mechanismen noch nicht endgültig geklärt werden.

In unserem Modell zeigen die Cytochrom C Western Blot-Ergebnisse eindeutig, dass nur der mitochondriale Weg eine Rolle spielt. Dabei führt der signifikante Anstieg des Proteins in der zytosolischen Fraktion mit hoher Wahrscheinlichkeit zur Aktivierung der Caspasekaskade. Von entsprechenden Resultaten berichten Piper et al. 154, die in ihren Versuchen an isolierten Meerschweinchenmitochondrien die Freisetzung von Cytochrom C während der Ischämie nachweisen konnten.

Abb. 33: Die Abbildung zeigt die verschiedenen Apoptosekaskaden der Kardiomyozyten. Einerseits führen bestimmte Stressfaktoren (z.B. Ischämie) zur Freisetzung von Cytochrom C und AIF aus den Mitochondrien. Andererseits aktiviert die Anlagerung von TNF-alpha und FAS-Ligand die Caspase 8. In beiden Fällen spalten die Zwischenprodukte die terminale Caspase 3, gefolgt von der Fragmentierung der DNA.

4.2. Mechanismus und Hemmung der Cytochrom C bedingten Apoptose

Seitdem der Übergang von Cytochrom C aus den Mitochondrien in das Zytosol als essentieller Schritt der Ischämie-bedingten Apoptose entdeckt wurde, herrscht Uneinigkeit über die genauen Mechanismen der Freisetzung. Insbesondere der nahezu vollständige Erhalt der Mitochondrienmorphologie während der Freisetzung von Cytochrom C bietet reichlich Diskussionsstoff 54. Mittlerweile geht V. Diskussion - 95 man allerdings davon aus, dass die mitochondriale „permeability transition“ (MPT) sowie die obligatorisch folgende Öffnung der „permeability transition“-Pore (PTP) die Freisetzung der Apoptoseinduktoren verursacht 155.

Dieses Modell stützt sich unter anderem auf eine Veröffentlichung von Kroemer et al. 1 5 5, worin sie beschreiben, dass spezielle Inhibitoren (z.B. „bongkrekic acid“) der mitochondrialen PTP die Apoptose verhindern, während die durch Atractyloside eingeleitete Porenöffnung Apoptose induziert.

Während der Ischämie wird die PTP durch den beschriebenen intrazellulären Anstieg der Ca2+-Ionenkonzentration geöffnet. Durch das daraufhin einfließende Wasser schwellen die Mitochondrien an und es kommt zum Konzentrationsausgleich zwischen Zytoplasma und innerer Mitochondrienmatrix. In diesem Zusammenhang ist zu bedenken, dass die innere Mitochondrienmembran aufgrund der vielen Cristae eine weitaus größere Oberfläche hat als die äußere Membran.

Folglich führt die Schwellung der inneren Matrix unweigerlich zur Ruptur der äußeren Membran, wobei der Inhalt des intermembranösen Spaltes in das Zytosol abgegeben wird 68 (Abb. 34). Diesbezüglich berichteten Vander Heiden et al. 156, dass Antikörper gegen die mitochondriale Cytochrom-Oxidase durch die rupturierte äußere Membran in die Mitochondrien apoptotischer Zellen eindringen konnten, während dies in Kontrollzellen nicht möglich war. Das durch die Ruptur freigesetzte Cytochrom C bildet mit Apaf-1 einen Komplex, der in Anwesenheit von dATP die zur Apoptose führende Caspasekaskade aktiviert.

Neben der Freisetzung von Cytochrom C bedingt die Öffnung der PTP vor allem den Zusammenbruch des Transmembranpotentials. Dieses etwa -150 bis –200 mV betragende Potential 89 resultiert aus der physiologischerweise vorliegenden asymmetrischen Protonenverteilung beiderseits der inneren Mitochondrienmembran 157.

Abb. 34: Nach der Ca2+-induzierten Öffnung der „permeability transition“-Pore (PTP) schwellen die Mitochondrien durch das in die innere Matrix einfließende, Wasser an. In diesem Modell führt die Schwellung zur Ruptur der äußeren Membran, wobei Cytochrom C und AIF freigesetzt wird.

- 96 - V. Diskussion Folglich führt das Einfließen von Protonen durch die geöffnete PTP zum sofortigen Verlust des elektrischen Gradienten. Dies ist ein Vorgang, den Zamzami et al. 158 als „point-of-no-return“ in Bezug auf den programmierten Zelltod definierten.

Andererseits hemmt der spezifische PTP-Inhibitor CsA den Zusammenbruch des elektrischen Potentials 159.

Aber nicht nur die Versuche von Zamzami et al. 158, sondern auch der Bericht von Halestrap et al. 160 stützen das „permeability transition“-Modell. Darin beschreiben sie, dass CsA die Calcium-induzierte Schwellung der Mitochondrien durch Bindung an Cyclophilin D hemmt. Dieses als Baustein der PTP (Abb. 3) bekannte Protein unterscheidet sich deutlich von den zytoplasmatischen Cyclophilinen 161, wobei die Bindung mit CsA die Öffnung der Pore verhindert. Diese Tatsache wurde mittlerweile von vielen Wissenschaftlern belegt 162-164. Im Gegensatz dazu zeigt das neuerdings zur Immunsuppression eingesetzte FK-506 aufgrund der fehlenden Bindungsstelle für Cyclophilin D keinen Effekt auf die PTP 165.

In Bezug auf unsere Versuche bestätigen vor allem die Ergebnisse der Cytochrom C Western Blots das Zutreffen der Modellvorstellung. Dabei weist der bei allen Hunden nachgewiesene Abfall von Cytochrom C in der partikulären Fraktion auf eine Ruptur der äußeren Mitochondrienmembran während der Ischämie. Des weiteren ließ sich die Freisetzung des Proteins durch die Hemmung der PTP mit CsA signifikant um 50% reduzieren. In diesem Zusammenhang korrelierten die stärkeren Banden der zytosolischen Fraktion der B-Biopsie eindeutig mit dem Verlust des Cytochrom C’s in der partikulären Fraktion. In diesem Kontext ist auch die durch CsA hervorgerufene vollständige Blockade der Calcineurinaktivität während Ischämie und Reperfusion hervorzuheben. Sie beweist, dass CsA in vivo in die Herzmuskelzellen eindringt und dort während des gesamten Versuchs in aktiver Form persistiert.





Dementsprechend ist die Reduktion der Apoptoserate in der behandelten Gruppe mit hoher Wahrscheinlichkeit auf die Hemmung der PTP durch CsA zurückzuführen. Dass es sich hierbei nicht um eine vollständige Blockade aller mitochondrialen Poren handelt, verdeutlicht der um 30% reduzierte Mittelwert der Cytochrom C-Gesamtmenge nach 18stündiger Ischämie. Trotzdem korreliert die 50%ige Reduzierung der Cytochrom C-Freisetzung mit der 50%igen Abnahme der Apoptoserate in den CsA-perfundierten Tieren.

Allerdings erklären weder die bisher beschriebenen Resultate noch das Modell der „permeability transition“-Pore (PTP), warum die Ausschüttung von 50% bzw. 25% der Cytochrom C-Gesamtmenge nur in 6% bzw. 3% der Herzmuskelzellen zum apoptotischen Zelltod führte. Folglich müssen die Herzmuskelzellen über spezielle V. Diskussion - 97 hochwirksame anti-apoptotische Mechanismen verfügen. Dazu gehören nach heutigem Wissensstand die anti-apoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie, deren Bedeutung im folgenden Kapitel diskutiert wird, sowie die endogenen Caspaseinhibitoren IAP-1 166 und XIAP (X-linked IAP) 167. Diese sogenannten „Inhibitors of Apoptosis“ (IAP) hemmen in vitro durch direkte Interaktion mit den Caspasen 3 und 7 den obligatorisch eintretenden apoptotischen Zelltod 168. Dabei besitzen diese Proteine ein bis drei BIR (baculovirus IAP repeat)-Regionen, die eine essentielle Bedeutung für ihre Funktion haben 167. Um zu klären inwieweit dieser Schutzmechanismus in unserem Modell eine Rolle spielt, müsste man die Caspaseinhibitoren während der Ischämie inaktivieren.

Außerdem ist bisher noch nicht erforscht, welche zytosolische Cytochrom CKonzentration zur Induktion der Apoptose notwendig ist 147. Theoretisch wäre denkbar, dass nur in wenigen Zellen der Grenzwert überschritten wird, während die Konzentration in den meisten Zellen unterhalb des Schwellenwertes bleibt.

5. Mechanismen der Apoptoseregulation durch die Bcl-2 Proteinfamilie

Neben den Caspasen als Exekutoren repräsentieren die Mitglieder der Bcl-2 Proteinfamilie die wesentlichen Regulatoren der Apoptose. Diesbezüglich untersuchten Ellis und Horvitz 169 im Jahre 1986 die Entwicklung des Nematoden Caenorhabditis elegans. Dabei entdeckten sie drei der wichtigsten apoptoseregulierenden Gene, die sie CED-3, -4 und –9 (C. elegans death gene) nannten. Die ersten beiden sind essentiell für den Ablauf der Apoptose, während CED-9 anti-apoptotische Eigenschaften hat. Mittlerweile haben verschiedene Forscher konservierte Homologe dieser Gene im Genom der Säugetiere gefunden, wobei die Caspase 3 dem CED-3-Genprodukt und Bcl-2 dem CED-9-Genprodukt entspricht 146.

Nachfolgend sollen die vier verschiedenen Wirkungsmechanismen von Bcl-2 und dem nahe verwandten Gegenspieler Bax sowie die Bedeutung der beiden Regulatoren für das beschriebene Modell dargestellt werden.

5.1. Antioxidative Effekte Die zentrale Funktion reaktiver Sauerstoffradikale bei der Apoptose wurde erstmalig von Hockenbery et al. 170 angedeutet. Bei ihren in vitro Versuchen führte die Behandlung mit dem Sauerstoffradikal-erzeugenden Menadion zum dosisabhängigen Zelltod. Dies ist ein Prozess, der in Bcl-2 überexprimierenden

- 98 - V. Diskussion Zelllinien nicht stattfand. Aus ihren Ergebnissen schlossen die Wissenschaftler, dass Bcl-2 entweder direkt als Radikalfänger fungiert oder indirekt die Erzeugung der Radikale hemmt.

Diese Hypothese wurde durch spätere Beobachtungen von Jacobson und Raff 171 in Frage gestellt. Nach Kultivierung ihrer Zelllinie unter anaeroben Bedingungen konnten sie die anti-apoptotische Wirkung von Bcl-2 auf Staurosporin-induzierte Apoptose nachweisen, obwohl die Erzeugung von Sauerstoffradikalen unter diesen Umständen stark reduziert war.

5.2. Sequestration von Apaf-1

Dieser hypothetische Mechanismus beruht auf der Erkenntnis, dass das als C. elegans-Homolog des Bcl-2’s bekannte CED-9 durch direkte Interaktion mit CED-4 die Apoptose verhindert 172,173. Dabei hemmt CED-9 die in vitro unter ATPVerbrauch nachgewiesene Aktivierung des CED-3’s durch CED-4. In Anbetracht der Tatsache, dass es sich beim Genprodukt des CED-4’s um ein Homolog des Säugetierproteins Apaf-1 handelt 174, könnte die Bindung von Bcl-2 oder Bcl-xL an Apaf-1 eine wichtige Bedeutung bei der Hemmung der Apoptose haben (Abb. 35).

Entsprechende Berichte über die Komplexbildung von Apaf-1 und Bcl-xL wurden zwischenzeitlich veröffentlicht 175. Dementsprechend würde die Heterodimerisation von Bax mit Bcl-xL zu einer Freisetzung von Apaf-1 mit nachfolgender Apoptose führen 69. Ein ähnlicher Mechanismus wurde beim Nematoden C. elegans entdeckt, wobei Egl-1 als Protein der BH3-Familie die Ablösung von CED-9 bewirkt 176 (Abb. 35). Inwieweit Bcl-2 die als „Apoptosome“ bezeichneten Sequester mit Apaf-1 bildet und welche Rolle dieser Mechanismus in vivo spielt ist bisher unbekannt.

5.3. Mitochondriengekoppelte Wirkungsmechanismen

Den evolutionsgeschichtlich ältesten Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen der Bcl-2-Familie und den Mitochondrien lieferte der Nachweis, dass beim Nematoden C. elegans das Bcl-2 Homolog CED-9 und Cytochrom B von der gleichen mRNA codiert werden 177. Dies stimmt überein mit einer Vielzahl von Untersuchungen, die zeigen, dass die anti-apoptotische Wirkung von Bcl-2 vor der Aktivierung der Caspasen auftritt. Folglich fungieren die Bcl-2-Familienmitglieder als Regulatoren der Mitochondrien-induzierten Apoptose 172,173. Dabei stehen zwei grundverschiedene Wirkungsmechanismen zur Diskussion.

V. Diskussion - 99 Abb. 35: Vergleich zwischen dem programmierten Zelltod bei Säugetieren und beim Nematoden C. elegans. Während die Aktivierung von CED-3 beim Nematoden durch Abspalten von CED-9 erreicht wird, führen bei Säugetieren zwei unabhängige Schritte zur Caspasenaktivierung. Zuerst muss das Bcl-2-Familienmitglied von Apaf-1 abgespalten werden und danach erfolgt die Anlagerung von Cytochrom C.

5.3.1. Regulierung der mitochondrialen „permeability transition“-Pore

Bei diesem zentralen Regulationsmechanismus steuern die Mitglieder der Bcl-2Familie die Freisetzung pro-apoptotischer mitochondrialer Faktoren. Einerseits blockt die Überexpression von Bcl-2 den Übergang von Cytochrom C aus dem Zwischenmembranspalt in das Zytosol 178,179, andererseits hemmt Bcl-2 den Austritt von AIF aus isolierten Mitochondrien 176. Im Gegensatz dazu bewirkt Bax eine Schwellung der inneren Mitochondrienmatrix sowie die Freisetzung des mitochondrialen Cytochrom C’s.

Entsprechend der beschriebenen Effekte von Bcl-2 und Bax auf die Cytochrom Cund die AIF-Verteilung beeinflussen die beiden Proteine das mitochondriale Transmembranpotential. Während Bcl-2 die durch PT-Porenöffnung ausgelöste Depolarisation der Mitochondrien verhindert 179,180, induziert Bax den Verlust des Transmembranpotentials 181,182. Diese Resultate deuten auf eine Beteiligung der mitochondrialen PT-Pore bei der Steuerung der Apoptose durch Mitglieder der BclFamilie. Dafür spricht auch die Veröffentlichung von Narita et al. 1 8 1. Sie

- 100 - V. Diskussion beschreiben darin, dass die PT-Poreninhibitoren CsA und Bongkrekiksäure in der Lage sind, Bax-induzierte Veränderungen isolierter Mitochondrien zu hemmen.

Allerdings ist bisher noch nicht geklärt, wie Bcl-2 und Bax die PT-Porenöffnung im Detail beeinflussen.

Trotz dieser eindeutigen Ergebnisse teilen sich die Meinungen in Bezug auf die Bedeutung der PTP. Insbesondere die Untersuchungen von Eskes et al. 183 stellen die Hypothese in Frage, da sie keine CsA-bedingte Hemmung der durch Bax ausgelösten Cytochrom C-Umverteilung in vitro feststellen konnten. Aber auch einige andere Studien belegen, dass Bax die Cytochrom C-Freisetzung unabhängig vom Transmembranpotential auslöst 184,185. Folglich gibt es neben der Porenöffnung weitere wirksame Mechanismen, die zur Ansammlung von Cytochrom C im Zytosol führen.

5.3.2. Porenbildende Eigenschaft der Bcl-2-Familie

Der erste diese Theorie unterstützende Anhaltspunkt ergab sich aus der dreidimensionalen Struktur des anti-apoptotischen Bcl-xL-Proteins 186. Bcl-xL ist aus sieben flexibel verbundenen Helices aufgebaut, wobei nur die zwei zentralen hydrophoben alpha-Helices (alpha 5 und alpha 6) für die porenbildende Funktion des Proteins von Bedeutung sind 187. Eine Eigenschaft, die außer bei Bcl-xL auch bei den strukturell sehr ähnlichen Bcl-2- und Bax-Proteinen auftritt.



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