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«Die protektive Wirkung von Cyclosporin A während der Ischämie und der Reperfusion Untersuchungen am global ischämischen Hundeherzen ...»

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Neben den beschriebenen Mechanismen könnte es sich bei der eingeschränkten Funktion auch um das sogenannte „myocardial stunning“ handeln. Dieses Phänomen wird durch Störungen der Calciumhomeostase 46 und durch die Bildung freier Radikale ausgelöst 47. Beide Auslöser schädigen den kontraktilen Apparat der Herzmuskelzellen und führen zu einer anhaltenden Dysfunktion des Myokards während der Reperfusion (siehe Punkt 2.4. des Literaturteils). Zur Klärung habe ich das kontraktile Aktin sowie das Gerüstprotein alpha-Aktinin immunhistologisch untersucht. Allerdings ergab die Auswertung der Präparate keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen und auch sonst weist keine Veröffentlichung auf die Hemmung von „myocardial stunning“ durch CsA hin.

Folglich ist das Phänomen als Ursache für die verringerte end-systolische Elastizität höchst unwahrscheinlich.

Insgesamt machen die Ergebnisse deutlich, dass die Kombination von Hypothermie, Kardioplegie und Perfusion mit CsA-angereicherter UW-Lösung die Ischämietoleranz global ischämischer Herzen signifikant verbessert. Dabei führt die Hemmung der mitochondrialen „permeability transition“-Pore durch CsA zu einer verbesserten funktionellen Erholung und zu einer drastischen Verringerung des ultrastrukturellen Schädigungsgrades.

Zum Abschluss des Kapitels sollen die Ergebnisse der alpha-Aktininmarkierung beurteilt werden. Diese Färbung zeigte in allen Kontroll- und Ischämiepräparaten eine intensive und gleichmäßige Querstreifung, die in den Reperfusionspräparaten von deutlichen Auflösungserscheinungen unterbrochen wurde. Da die Schäden erst nach Beendigung der globalen Ischämie auftraten, werden sie vermutlich durch V. Diskussion - 89 metabolische Veränderungen zu Beginn der Reperfusion verursacht. Hierzu zählen insbesondere der mehrfach beschriebene plötzliche Anstieg der intrazellulären Ca2+Ionenkonzentration sowie die massive Bildung von freien Radikalen in den ersten Minuten. Hierbei wäre einerseits eine Schädigung des alpha-Aktinins durch aktivierte Ca2+-abhängige Proteasen denkbar, andererseits könnten die freien Radikale die Auflösungserscheinungen der zellulären Proteine durch direkte Einwirkung auslösen 18.

3. Apoptose und Nekrose

Außer den im vorherigen Kapitel beschriebenen ischämischen Schädigungen führt vor allem der im Verlauf der Ischämie und der Reperfusion auftretende Zelltod zur Einschränkung der Ischämietoleranz. Hierbei unterscheidet man grundsätzlich zwischen nekrotischem und apoptotischem Zelltod.

3.1. Nachweis und Bedeutung der Nekrose im Tiermodell Im Jahre 1978 beschrieben Jennings et al. das erste Mal den Verlauf letaler ischämischer Schädigung nach Koronarokklusion. Sie erkannten an ihrem Hundemodell, dass nach 40minütiger normothermer Ischämie 50% der Myozyten im Papillarmuskel nekrotisch waren. Weitere 20 Minuten führten in ihrem Modell zur Nekrose aller betroffenen Zellen. Von ähnlichen Resultaten berichteten später andere Gruppen, die in verschiedenen in vivo Langzeitischämie-Modellen bis zu 90% Nekrose ermittelten 133,134.

Ein ganz anderes Bild ergab die histologische Auswertung der im Verlauf des Versuchs entnommenen Biopsien. In keinem der elektronenmikroskopisch beurteilten Schnitte konnten eindeutige Anzeichen von Nekrose gefunden werden.

Und auch in der zur Absicherung durchgeführten Complement C9-Färbung zeigte keine der Herzmuskelzellen eine positive Markierung. Da weder die CsAbehandelten noch die unbehandelten Herzen Nekrose zeigten, muss die Perfusion mit UW-Lösung für den guten Erhalt des Gewebes verantwortlich sein.

Hierbei sind die während der Ischämie ausgelösten Zellschäden von den nach der Ischämie auftretenden letalen Reperfusionsschäden abzugrenzen. Erstere werden durch die Wirkung der unter Punkt 1.3. beschriebenen protektiven Inhaltsstoffe der kardioplegischen Lösung sowie durch die Hypothermie verhindert. Die letalen Reperfusionsschäden werden jedoch durch bisher noch weitgehend ungeklärte Mechanismen gehemmt. Entsprechend den im Literaturteil (siehe Punkt 2.5.) beschriebenen potentiellen Ursachen werden diese Schäden normalerweise durch

- 90 - V. Diskussion die zu Beginn der Reperfusion auftretende schnelle Rephosphorylierung des ATP’s sowie durch die schnelle Normalisierung des intrazellulären pH’s und der Gewebeosmolarität hervorgerufen 4 9. Vermutlich bewirkt die einzigartige Zusammensetzung der UW-Lösung eine besondere Stabilisierung der Stoffwechsellage zum Ende der Ischämie, so dass es nicht zu den beschriebenen drastischen Schäden während der Reperfusion kommt.

Eine besondere Rolle spielt dabei der Erhalt der hochenergetischen ATP-Reserven.

Diesbezüglich berichteten Leist et al. 135 von einem ATP-abhängigen Wechsel zwischen Apoptose und Nekrose. Bei ihren in vitro-Versuchen reichte eine Verminderung der intrazellulären ATP-Vorräte von mehr als 50% aus, um humane T-Zellen nach Stimulation nekrotisch werden zu lassen. Im Gegensatz dazu starben die T-Zellen mit mehr als 50% der physiologischen ATP-Vorräte einen apoptotischen Zelltod. Übertragen auf unser Modell wären dementsprechend der über 50%ige ATP-Gehalt zum Ende der Ischämie eine mögliche Ursache für die Abwesenheit der Nekrose.

3.2. Nachweis und Bedeutung der Apoptose im Tiermodell

Nachdem einige Wissenschaftler apoptotische Zellen in ischämischem und reperfundiertem Gehirn- 136 und Nierengewebe 137 entdeckt hatten, beschrieb Gottlieb et al. 138 1994 die durch Ischämie ausgelöste Apoptose von Kaninchenkardiomyozyten. Seitdem wurde das Auftreten apoptotischer Herzmuskelzellen in Verbindung mit Ischämie und Reperfusion vielfach in Tiermodellen 139 und im menschlichen Myokard 140 dokumentiert.





Bei den hier durchgeführten Versuchen wurde der Anteil apoptotischer Zellen mit Hilfe der TUNEL-Methode und der Lamin B1-Färbung ermittelt. Diese Kombination zweier Methoden entspricht den Empfehlungen von Schaper et al. 60. Sie reagieren damit auf die aktuelle Kritik an der TUNEL-Methode, die nachweislich unter bestimmten Umständen nekrotische Zellen 141 und Kerne mit DNAReparatur 142 markiert. Trotzdem gilt die Methode nach sorgfältiger Standardisierung und in Verbindung mit der Lamin B1-Färbung als zuverlässig.

Während die zu den „intermediate filament“-Proteinen gehörenden Lamine unter physiologischen Bedingungen der Organisation des Chromatins dienen, erfolgt im Verlauf der Apoptose eine Spaltung dieser Kernmembranproteine. Diese von verschiedenen Arbeitsgruppen beschriebene Proteolyse 143,144 beruht laut den Untersuchungen von Zhivotovky et al. 145 auf einem Zusammenspiel zweier Proteasen.

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nach 6h Reperfusion. Dabei sind die deutliche Korrelation mit den Ergebnissen der Lamin B1-Färbung sowie das Fehlen von Nekrose eindeutige Hinweise auf das Vorliegen apoptotischer Prozesse in den TUNEL-positiven Myozyten.

Für diesen auffällig geringen Anteil an apoptotischen Zellen gibt es zwei mögliche Erklärungen. Erstere beruht auf den von Gottlieb 146 zusammengefassten Veröffentlichungen, die den Zusammenhang zwischen intrazellulärem pH-Wert und Apoptose beschreiben. Sie beweisen einerseits, dass die Apoptose immer von einem pH-Abfall begleitet wird. Andererseits führte eine Hemmung dieser pHVeränderungen zu einer verzögerten oder vollständig gehemmten Apoptose. Eine mögliche Schlussfolgerung wäre, dass die geringe Apoptose-Rate in unserem Modell durch die Stabilisierung des pH-Wertes während der Ischämie verursacht wurde.

Diese Stabilisierung wird dabei durch den Abtransport der Protonen und die Pufferwirkung der UW-Lösung erreicht.

Die zweite Erklärung ergibt sich aus der Publikation von Haunstetter et al. 147.

Ihrer Meinung nach beruht die Resistenz der Kardiomyozyten auf speziellen antiapoptotischen Strategien der Zelle, wobei der genaue Mechanismus unter Punkt

4.2. beschrieben wird. Folglich wäre dieser Schutz verantwortlich für das massive Überleben der Herzmuskelzellen.

Aber nicht nur die absolute Anzahl, sondern auch die Verteilung der apoptotischen Zellen ist bei der Beurteilung der Ergebnisse von großer Bedeutung. Dieser Kontext lässt sich am einfachsten am Beispiel der Nekrose verdeutlichen. Hierbei kann ein großer Zellverlust infolge eines lokal begrenzten Infarkts ausgeglichen werden, während die, durch die Applikation von Katecholaminen ausgelöste, diffuse geringgradige Nekrose zum Herzversagen führt.

Dies beweisen einerseits die Infarktmessungen von Pfeffer et al. 148, der eine Beeinträchtigung der Ventrikelkontraktionen erst ab einer Infarktgröße von 31% der Ventrikelwand nachweisen konnte. Andererseits berichtete Kostin, dass schon eine 15%ige diffuse Nekrose massivste Einschränkungen der hämodynamischen Parameter zur Folge hat.

Vermutlich liegt die Ursache in der Ablösung der toten Zellen. Hierdurch verlieren die intakten Nachbarzellen die für die Reiz- und Kraftweiterleitung notwendigen Zell-zu-Zell-Kontakte, gefolgt von massiven Störungen der komplexen Ventrikelfunktion.

Die im vorliegenden Modell gefundene gleichmäßige diffuse Verteilung der apoptotischen Herzmuskelzellen entspricht den Verhältnissen nach Katecholamingabe.

Da aber nur 6% der Myozyten betroffen sind, führt der Verlust der Zellen nicht zum Herzversagen, sondern resultiert in einer reduzierten end-systolischen Elastizität.

- 92 - V. Diskussion Im Gegensatz dazu stieg der prozentuale Anteil an TUNEL-positiven Herzmuskelzellen in den CsA-behandelten Hundeherzen nur auf 2,4% zum Ende der Reperfusion. Und obwohl die betroffenen Zellen ebenfalls diffus im Gewebe verteilt vorlagen, beeinträchtigten sie die Funktion der Herzen nicht. Hieraus lässt sich folgern, dass das Herzgewebe in der Lage ist, Zellverluste bis zu einem bestimmten Grenzwert ohne Einschränkung der Funktion auszugleichen. Dieser liegt laut unseren Resultaten für diffus verteilte apoptotische Zellen im Bereich zwischen 2,4 und 6% der Gesamtmyozyten. Außerdem beweisen die Ergebnisse, dass CsA während der globalen Ischämie am Hundeherz anti-apoptotisch wirkt, wobei der genaue Mechanismus unter Punkt 4.2. erläutert wird.

Des weiteren soll die Frage diskutiert werden, ob die Apoptose während der Ischämie ausgelöst wird, oder ob es sich um sogenannte letale Reperfusionsschäden handelt. Diesbezüglich zeigten Gottlieb et al. 138 in einer Kaninchen-Studie, dass die Apoptose nur durch Reperfusion verursacht wird, wohingegen Fliss et al. 139 apoptotische Zellen in Rattenherzen nach 2,75stündiger Ischämie fanden. Einen Kompromiss bietet die Veröffentlichung von Freude et al. 134. Er beschreibt am Hundemodell, dass die Apoptose während der Ischämie eingeleitet und während der Reperfusion vervollständigt wird.

Diese Hypothese entspricht den am beschriebenen Modell gefundenen Ergebnissen.

Einerseits konnten direkt nach der Ischämie keine TUNEL-positive Zellen nachgewiesen werden. Andererseits können letale Reperfusionsschäden aufgrund der gleichbleibenden Funktionsbeeinträchtigung während der Reperfusion ausgeschlossen werden. Würde die Apoptose erst nach der Ischämie eingeleitet werden, wäre eine funktionelle Verschlechterung im Verlauf der Reperfusion zu erwarten. Ein weiterer Hinweis ergibt der, von Suzuki et al. 149 bestimmte, zeitliche Verlauf der Apoptosekaskade in adulten Rattenkardiomyozyten. In seinem in vitroModell konnte er die DNA-Fragmentierung erst nach 14 Stunden mittels der TUNEL-Methode und Elektronenmikroskopie darstellen. Unter der Annahme, dass die Apoptose in vivo ähnlich verläuft, wäre eine vollständige Kaskade während der 6stündigen Reperfusion nicht möglich.

Zusammengefasst verdeutlichen die Ergebnisse, dass die Reduktion der endsystolischen Elastizität in der unbehandelten Gruppe sowohl durch ischämische Beschädigung wie auch durch die im Verlauf der Ischämie eingeleitete Apoptose verursacht wird. Beide Faktoren werden durch die Perfusion mit CsA signifikant gehemmt, wodurch sich die Funktion in der behandelten Gruppe direkt nach der Ischämie vollständig erholt.

V. Diskussion - 93 Regulation und Hemmung der Apoptose

4.1. Auslöser und übergeordnete Mechanismen der Apoptose Grundsätzlich unterscheidet man zwei während der Einleitungsphase ausgelöste Mechanismen der Apoptose 150. Die Aktivierung des ersten Mechanismus erfolgt über Zellmembran-gebundene Todesrezeptoren, die direkt die Caspase 8 und 10 aktivieren. Der zweite Mechanismus führt über einen komplizierten mitochondrialen Weg zur typischen Spaltung der DNA.

Der rezeptorvermittelte Weg wird durch die Anlagerung vom Fas-Liganten oder TNF-alpha (Tumor-Nekrose-Faktor-alpha) an die entsprechenden transmembranösen Fas-(CD95) oder TNF-Rezeptorproteine eingeleitet 151. Dies bewirkt eine Trimerisation des Rezeptors mit nachfolgender Rekrutierung der „death domain“ des FADD (Fas-associated death domain) Proteins. Anschließend trimerisiert der Komplex mit der Prodomäne von Procaspase 8, wobei die aktivierte Caspase 8 entsteht. Im Falle einer Aktivierung des TNF-Rezeptors weicht der Weg etwas ab, da dieser Rezeptor FADD nicht direkt sondern nur über ein als TRADD (TNFreceptor- associated death domain ) bezeichnetes Verbindungsprotein binden kann.

Die dementsprechend aktivierte Caspase 8 gehört zu den Exekutoren der Apoptose.

Deren Name setzt sich aus ihrem zentral gelegenen Cysteinmolekül und der Aspartat-spezifischen Substratspaltung zusammen: „cytosolic-aspartate-specificcystein-protease“ = Caspase 151.

Die Caspasen liegen im Zytosol immer als Procaspase vor, die bei der Aktivierung in eine 20 kDa und eine 10 kDa Untereinheit gespalten werden. Erst nachdem die beiden zusammengelagerten Fragmente ein sogenanntes Heterotetramer gebildet haben, ist das Enzym voll funktionsfähig 150.

Die so aktivierte Caspase 8 besitzt wiederum das Potential zur Spaltung der am weitesten terminal gelegenen Caspase 3. Diese spaltet während der Degradationsphase zelluläre Substrate, wie Aktin, Lamin und das DNA-Reparaturenzym PARP 152. Außerdem aktiviert das Enzym den DNA-Fragmentierungs-Faktor (DFF) 146, der die typischen apoptotischen Kernveränderungen hervorruft (Abb. 33).

Nach einem ganz anderen Muster verläuft die Induktion der Apoptose über den mitochondrialen Weg. Hierbei verursacht eine Vielzahl von Induktoren (z.B. Ischämie) die Aktivierung zweier Mitochondrien-abhängiger Mechanismen.

Einer dieser Mechanismen führt nach Freisetzung von Cytochrom C zur Aktivierung der Caspase 9, die wiederum die Caspase 3 spaltet (siehe Punkt 5.2.



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